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LAL試驗快速檢測肉品細菌污染程度及鮮度的研究
?！≌?王登臨,董瑞鵬,楊紅巖,張 蕾
(甘肅省動物檢疫總站,甘肅蘭州730030)
[摘要]
對不同鮮度的豬肉、牛肉、羊肉、雞肉和魚肉進行活菌總數(shù)、革蘭氏陰性菌數(shù)、大腸菌群數(shù)及揮發(fā)性鹽基氮(TVB_N)測定,并與LAL試驗(鱟變形細胞溶解物試驗)進行平行對比研究,證實肉品的鮮度與其細菌總數(shù)、革蘭氏陰性菌數(shù)及LAL指數(shù)呈負相關(guān)性。應(yīng)用LAL試驗可在短時間(1～ 2小時)內(nèi)快速判定肉品的細菌污染程度及鮮度,比傳統(tǒng)的細菌培養(yǎng)計數(shù)法大大縮短了時間,適合現(xiàn)場大批量肉品細菌污染程度及鮮度的快速檢測。
關(guān)鍵詞: 肉品; 細菌污染; LAL試驗; 快速檢測
中圖分類號: S852.61 文獻標識碼: A 文章編號:1008_0589(2002)04_0304_06
Rapid Determination of Bacterial Contamination and Freshness of Meat by LAL TestWUZheng,WANG Deng_lin,DONG Rui_peng,YANG Hong_yan,ZHANG Lei(Gansu Provincial Animal Quarantine Station 730030,China)Abstract: Three different freshness samples of pork,beef,mutton,chicken and fish were examined for the numbers of total viable cells,gram_negative organisms,colifrom groups and the value of TVB_N.The resultswere comparedwith those of LALtest(limulus amoebocyte lysatetest).A positive correlationwas observed among the total viable cells,gram_negative organisms and LALindexes. It indicated that LALtest in-dex can be used to determine the bacterial contamination and freshness of the meat rapidly.
Key words: Meat;Bacterial contamination;LALtest;Rapid determination
肉品的衛(wèi)生質(zhì)量關(guān)系到廣大人民群眾的食肉安全,而肉品細菌污染程度是反映其衛(wèi)生質(zhì)量的重要指標?？焖贉蚀_檢測肉品細菌污染程度及鮮度,保證廣大消費者吃上“放心肉”,是動物檢疫機構(gòu)和衛(wèi)生部門亟待解決的問題。目前,國內(nèi)檢測肉品新鮮度的主要方法是感官鑒定和實驗室揮發(fā)性鹽基氮(TVB_N)測定。感官鑒定的不足之處是結(jié)果不易量化,存在主觀性和片面性;TVB_N測定變化有時不敏感,肉品變質(zhì)程度與肉品中TVB_N含量變化呈非正相關(guān)[1]。肉品細菌污染程度的檢測是判定肉品鮮度的一種準確、客觀的方法,常用的為細菌活菌總數(shù)培養(yǎng)計數(shù)法和大腸菌群數(shù)測定法,但檢驗一個樣品至少需用48小時,費時費力,很不適應(yīng)于當今快速肉品消費市場的檢測[1]。
細菌的快速檢測,是指在檢驗樣品的過程中,無需進行細菌的分離培養(yǎng)、生化試驗等項目的檢驗,而是利用一定的方法在幾小時甚至更短的時間內(nèi)從樣品中直接確定是否有細菌、細菌代謝產(chǎn)物存在,定性、定量,以達到對細菌污染程度進行判定的目的。國外對肉品中細菌快速檢測已建立了如基因探針檢驗、氣相色譜及免疫酶等多種方法,但這些方法主要用于一些特異性病原菌的檢測,很難全面反映肉品細菌的污染程度,且所需試劑昂貴,設(shè)備要求高,未能得到廣泛應(yīng)用。
肉品細菌污染主要是由畜禽屠宰加工過程中革蘭氏陰性腸道細菌所致。革蘭氏陰性細菌胞壁中含有特殊成分—脂多糖,即為革蘭氏陰性菌內(nèi)毒素。鱟血細胞內(nèi)含有可凝蛋白、B因子、凝固酶原等蛋白凝固因子,內(nèi)毒素同鱟試劑反應(yīng)可形成肉眼可見的凝膠。國外學(xué)者已對利用LAL試驗快速檢測肉品細菌污染程度進行了一些研究[2,3]。國內(nèi)一些研究人員已把LAL試驗用于食品中細菌內(nèi)毒素含量的測定[4],但在檢測肉品細菌污染程度及新鮮度方面的應(yīng)用還未見報道。
1 材料和方法
1.1 鱟試劑 靈敏度為2EU/ml,由廈門鱟試劑廠提供,批號為980708和981103。每批使用前按說明用內(nèi)毒素陽性標準品測定其靈敏度。
1.2 鱟試劑溶解水及稀釋液 鱟試劑溶解水為廈門鱟試劑廠生產(chǎn)的無熱原水;稀釋液為LAL試驗檢測陰性的注射用生理鹽水。
1.3 細菌培養(yǎng)基及化學(xué)試劑 營養(yǎng)瓊脂、乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基、乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基、伊紅美藍瓊脂均為成品培養(yǎng)基;所用化學(xué)試劑均為分析純級。
1.4 試驗肉品 豬肉:市場采集的一級鮮度肉28份,二級鮮度肉2份;人工二級鮮度肉5份,人工變質(zhì)肉11份;牛肉:市場采集的一級鮮度肉5份;人工二級鮮度肉5份,人工變質(zhì)肉3份;羊肉:市場采集的一級鮮度肉3份;人工二級鮮度肉3份,人工變質(zhì)肉2份;雞肉:市場采集的一級鮮度肉6份;人工二級鮮度肉3份,人工變質(zhì)肉2份;魚肉(淡水魚):市場采集的一級鮮度肉6份;人工二級鮮度肉2份,人工變質(zhì)肉2份(人工二級鮮度和人工變質(zhì)肉是將新鮮肉在室溫下或在37℃恒溫箱內(nèi)放置一定時間后獲得)。
1.5 LAL試驗方法 將鱟試劑安瓿打開,加入0.1ml鱟試劑溶解水使凍干物充分溶解,然后加入等量的待檢肉樣稀釋液,搖勻置37± 0.5℃恒溫水浴鍋中靜置60± 2分鐘,取出后觀察結(jié)果。同時設(shè)陰性對照、陽性對照及抑制對照。鱟試劑凝固,呈膠凍狀,倒轉(zhuǎn)180度凝塊不變形、不流動判為陽性。以出現(xiàn)陽性反應(yīng)的肉樣稀釋液最高稀釋倍數(shù)計算LAL指數(shù)(為使鱟試劑發(fā)生凝固的肉樣稀釋液10倍稀釋的最高稀釋度指數(shù))及肉毒素含量。
1.6 肉樣處理和稀釋 在肉樣的精瘦肉處,從約4cm2大小范圍內(nèi)由表層向深層取5g肉,置滅菌燒杯中剪碎,加入45ml生理鹽水,放在磁力攪拌器上攪拌10～ 15分鐘,即成1∶10的肉浸液。吸取肉浸液1ml加入裝有9ml生理鹽水的試管中,充分混勻,即成1∶102稀釋液。依據(jù)肉樣新鮮程度(感官判定)依次稀釋至1∶105～ 1∶108。制備的稀釋液同時用于微生物學(xué)試驗及LAL試驗。
1.7 新鮮度鑒定及TVB_N測定 按GB5009.44_85《肉與肉制品衛(wèi)生標準分析方法》進行。
1.8 活菌總數(shù)及大腸菌群數(shù)測定 按GB4789.2_84和GB4789.3_84《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗》進行。
1.9 革蘭氏陰性菌數(shù)測定 選擇3個稀釋度肉樣稀釋液,接種伊紅美藍瓊脂平板,每個稀釋度接2個平板,每個平板接種0.2ml,搖勻后37℃培養(yǎng)48小時,計數(shù)生長的菌落。
1.10 LAL指數(shù)與細菌總數(shù)、革蘭氏陰性菌數(shù)、大腸菌群數(shù)及TVB_N值相關(guān)性對比分析 按生物統(tǒng)計學(xué)原理計算相關(guān)系數(shù)(r),分析LAL指數(shù)與其他試驗數(shù)值之間的相關(guān)程度。
2 結(jié) 果
2.1 肉品感官鑒定、TVB_N和微生物學(xué)指標測定及LAL試驗 由表1～ 5可見,不同種類、不同新鮮度的肉樣88份,隨著肉品新鮮度的降低,活菌總數(shù)、革蘭氏陰性菌數(shù)及大腸菌群數(shù)對數(shù)值均相應(yīng)升高,LAL指數(shù)和肉品內(nèi)毒素含量也都相應(yīng)升高;TVB_N值在豬肉、牛肉和羊肉也都出現(xiàn)相應(yīng)變化;不同新鮮度之間的各數(shù)值(除雞魚肉TVB_N值)有顯著差異(p< 0.01)。同等鮮度牛、羊肉TVB_N值、活菌總數(shù)、革蘭氏陰性菌數(shù)及LAL指數(shù)相近,無顯著差異(p> 0.05);但不同鮮度之間各數(shù)值有顯著的差異(p< 0.01)。因此,牛肉和羊肉可用同一指標進行判定。
2.2 LAL指數(shù)與活菌總數(shù)、革蘭氏陰性菌數(shù)、大腸菌群及TVB_V值相關(guān)性對比分析 用生物統(tǒng)計學(xué)原理計算相關(guān)系數(shù)(r),結(jié)果見表6。LAL指數(shù)與活菌總數(shù)、革蘭氏陰性菌數(shù)、大腸菌群數(shù)及TVB_V值的相關(guān)系數(shù)(r)均值分別為0.955、0.948、0.813和0.363;與其相關(guān)性依次為活菌總數(shù)>革蘭氏陰性菌數(shù)>大腸菌群數(shù)> TVB_V值。
參考文獻（略）
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